肿瘤是一种复杂的多基因疾病，很多肿瘤都可以检测到基因突变，这已经成为一种共识。在淋巴瘤组织里，染色体改变、基因突变都非常多见。高通量测序技术，又称“二代”测序技术（“Next-generation” sequencing technology，NGS），具有通量高、灵敏度高、成本低等优势，是探索血液肿瘤的分子发病机制并指导临床诊疗的重要手段。NGS在血液肿瘤的诊断分型、预后判断、指导治疗以及微小残留病监测中起到越来越重要的作用。

初诊弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）经过标准美罗华联合环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松（R-CHOP）方案治疗，超过60%患者的生存期显著提高，然而仍有超过30%的患者出现疾病复发或难治，用传统的化疗无法解决，导致这一部分患者最终失去治疗的机会。

在靶向免疫治疗时代，通过先进的技术手段，针对难治复发患者的突变基因进行基因测序有可能为患者筛选到有效的治疗药物。在治疗中联合靶向治疗，可以挽救一部分难治复发的患者，从而改善其治疗效果。

复发难治DLBCL的基因突变

NGS是测序技术发展历程的一个里程碑，该技术能在短时间内完成对上百亿碱基序列的检测，实现了高通量、高灵敏度和准确度的测序。迄今为止在DLBCL中已有超过262个外显子进行了NGS测序，其中一些突变发生在许多重要的基因中，这些基因在B细胞功能（如BCR信号，NF-KB信号通路，NORTH信号，TOLL样受体信号）、免疫、细胞周期/凋亡及表观遗传调控中发挥关键的作用。目前我们血液肿瘤二代测序可以检测339种基因突变，并且可检测基因突变数量在不断增多。

我们检测的目标人群主要是复发难治的DLBCL和原发纵隔的DLBCL。平均测序深度3000X以上。目前我们共检测了51例DLBCL，均为复发难治弥漫大细胞淋巴瘤穿刺组织。其中有4例为原发纵隔大B细胞淋巴瘤，共检测出317个基因突变，排名前5的分别是，TP53突变（53%）、PIM1突变（31%）、KMT2D突变（27%）、CREBBP突变（25%）、MYD88突变（25%）。

分子检测实验室专家在解读检测出的突变时会依据多个权威数据库，包括权威国际指南如NCCN临床实践指南、COSMIC数据库；多态性的健康人群数据库如1000Genome千人基因组计划数据库；针对新发突变的蛋白功能保守性评估及致病性预测；筛选敏感和耐药的靶向用药数据库；以及一些案例报道的国外医院开源数据库及 NCBI文献查阅。随着新的数据库及指南数量的不断增加，每次随着新药的出现，我们的检测的手段检测出来的基因的类型也在逐渐的增加。

典型病例分析

接下来以两个典型病例跟大家分享NGS基因检测在复发难治弥漫大B细胞淋巴瘤中的应用。

第1例患者，吴某，35岁，2017年12月诊断弥漫大B细胞淋巴瘤GCB型。在外院做过多个化疗，评估疾病进展（PD）。来我院做基因突变二代测序，并要求行CART治疗。二代测序结果提示患者存在TP53突变，KRAS突变。针对KRAS突变，提示该患者可选择从MEK抑制剂（如曲美替尼）获益。病人当时因胰头部包块导致梗阻性黄疸，淀粉酶、脂肪酶升高，暂无法行CART治疗。病人既往打的化疗也很多，临床能选择的化疗方案非常有限，此外，患者一般状况也较差。因此，我们根据基因突变二代测序结果，予以口服曲美替尼联合BCL-2抑制剂（venetoclax）治疗。口服后患者自觉腹痛明显改善。患者服用曲美替尼两周以后，胰头部位的梗阻明显改善，服用14天后，B超显示胰头部位变化不大，但是肾脏包块有所缩小。

第2例患者，张某，35岁。2018年1月以干咳、胸痛起病，纵膈病变穿刺活检诊断为弥漫大B细胞淋巴瘤累及纵膈。在外院打了多个疗程的化疗之后，纵隔始终还有比较大的包块。当时在外院做了基因突变，没有找到有意义的基因突变。患者还表达了想做CART治疗的意愿。来我院后做基因突变二代测序，提示TP53、BRCA2变异，此外，还检测到STAT3、STAT6基因变异，其功能影响暂时未有明确研究和文献报道，但软件分析预测为有害变异，分子检测专家建议结合其他检查结果及临床表型综合判断。根据基因突变检测结果所用靶向治疗药物，在CD19-CART治疗前给予单药BCL-2抑制剂（venetoclax），CD19-CART后针对STAT3、STAT6的突变给予舒尼替尼联合venetoclax，之后给予芦可替尼联合venetoclax靶向治疗。患者病灶大小保持稳定，病灶穿刺为坏死组织。

可以看出，上述两例患者通过靶向治疗取得了部分疗效，可能还需要结合免疫治疗或者其他治疗来获得更大的获益。可惜的是，这两例患者的肿块太大，选择免疫或靶向治疗的时机太晚，最终失去了治疗的机会。

因此，一旦肿瘤患者出现复发，在疾病早期没有特别危害到重要脏器的时候，如果就通过二代测序基因突变检测进行靶向和免疫治疗，就有可能把患者挽救过来。

小结

针对淋巴瘤患者，基于NGS的二代测序具有以下意义。，通过基因测序可以知道患者是否具有不良基因，如是否存在TP53突变。第二，通过基因测序可以筛选敏感靶向药，例如，如果患者同时存在MYD88与CD79B突变，可能对伊布替尼更敏感一些。

此外，有一些患者可能对伊布替尼这些常用的靶向治疗药物效果并不好。通过二代测序可以寻找到能用的其他的靶向治疗药物，比如曲美替尼，起到意向不到的治疗效果。随着分子生物学在血液肿瘤发病机制和临床诊疗研究的不断深入，NGS在淋巴瘤中的应用将会越来越广泛和高效。

医生介绍

郑培浩

具有十余年丰富的血液科临床经验，掌握基本的骨髓形态检查，对于各种类型的贫血、出凝血疾病、免疫性血小板减少性紫癜、恶性血液病如急慢性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、骨髓增殖性疾病等血液科常见疾病的诊治和新进展方面有深入了解，对于疑难血液病如不明原因发热、嗜血细胞综合征、8P11骨髓增殖综合征的诊治具有自己独到的见解。对于内科常见疾病的诊断和治疗亦有丰富经验。